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張巖課題組Cell合作發文首次揭示激活態多巴胺受體D1R和D2R配體選擇性和G蛋白選擇性的機理

編輯:林海燕 來源:基礎醫學系 時間:2021年02月18日 訪問次數:10  源地址

單胺類神經遞質是廣泛分布在人體內的一類化學信號分子,包括多巴胺(dopamine, DA)、腎上腺素(adrenaline)和五羥色胺(serotonin, 5-HT)等,這些信號分子共同調控人體內包括情緒以及記憶在內的多種生理功能并維持機體內環境穩態。多巴胺作為人體內一種重要的單胺類神經遞質,通過多巴胺能神經系統,對中樞神經系統(CNS)以及外周神經系統(PNS)的功能進行調控。多巴胺能信號主要由人體內一類被稱為多巴胺受體(dopamine receptors, DRs)的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor, GPCR)介導,包括D1R到D5R共五個受體成員。按照偶聯下游G蛋白種類的不同,這些受體可以進一步分為D1類受體和D2類受體兩組。其中,D1類受體包含D1R和D5R,主要與激活型G蛋白Gs偶聯,刺激下游第二信使環狀單磷酸腺苷(cAMP)的生成,而包括D2R,D3R和D4R在內的D2類受體則主要與抑制性G蛋白Gi/o偶聯,抑制cAMP形成。在五種DRs中,D1R和D2R是CNS中表達最為豐富的受體,主要分布在基底神經節和前額葉皮層中 1,2。D1R和D2R介導的多巴胺能信號對于獎賞、認知、運動協調和神經內分泌功能等在內的高級腦部功能至關重要,其發生異常與許多神經精神疾病密切相關,包括阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease, AD)、帕金森氏?。≒arkinson’s disease, PD)、精神分裂癥、認知障礙、注意力缺陷多動癥(Attention deficit hyperactivity disorder, ADHD)以及藥物成癮和濫用等。作為多巴胺受體家族的代表成員,D1R和D2R是治療PD以及精神分裂癥的熱門藥物靶點。

(圖源:https://www.cerveauetpsycho.fr/sr/cerveaux-confines/8-la-dopamine-recompense-du-confinement-19233.php)

D1R選擇性激動劑長期以來被認為是治療PD的有效方法,然而,目前上市的D1R激動劑藥物大多為D2樣受體的選擇性激動劑。已經開發的D1R選擇性激動劑由于受到代謝快(兒茶酚結構特征)以及無法透過血腦屏障等缺陷影響,尚無通過臨床研究用于神經精神類疾病治療 3;在治療精神分裂癥中,盡管可以通過目前的藥物作用D2樣受體來有效地治療正面癥狀,但它們在減輕負面癥狀和認知缺陷方面效率低下,而D1R選擇性激動劑則可以作為精神類疾病患者提高認知的潛在治療途徑。此外,D1R激動劑也被普遍認為是治療AHDH以及藥物成癮的有效治療方法。通過對D1R和D2R受體進行結構藥理學研究并揭示其配體選擇性的分子機制,對理解配體結合特性、受體激活以及設計更為高效的多巴胺受體靶向抗神經精神疾病類藥物具有重要的科學意義和臨床應用價值。

目前,盡管已有若干多巴胺受體亞型的結構獲得解析,包括D2R,D3R和D4R與拮抗劑結合復合物的晶體結構,以及D2R(突變型)與激動劑復合物的低分辨率冷凍電鏡結構,然而,對于D1類受體,尤其是D1R,自D1R基因被發現及克隆近30年來,其受體結構仍處于未知狀態,極大地限制了人們對D1R配體識別和受體激活機制的理解,成為制約基于結構的靶向D1R受體藥物研發的重要科學瓶頸。

針對以上科學難題,中美兩國科學家聯合攻關,來自中國科學院上海藥物研究所徐華強課題組和浙江大學基礎醫學院與浙江省良渚實驗室張巖課題組,聯合美國匹茲堡大學張誠課題組以及北卡羅來納大學教堂山分校Bryan L. Roth課題組等,應用冷凍電鏡技術(Cryogenic electron microscopy, Cryo-EM)首次解析了帕金森病治療藥物apomorphine(多巴胺受體泛激動劑)、D1R/ D5R選擇性全激動劑SKF81297以及G蛋白信號偏好性D1R/D5R選擇性部分激動劑SKF83959激活下D1R與下游Gs蛋白復合物的高分辨率冷凍電鏡結構,分辨率為2.9 ? - 3.0 ?。同時,科研人員解析了帕金森病治療藥物bromocriptine激活下D2R(野生型)與Gi復合物2.8 ?分辨率的冷凍電鏡結構(圖1)。這些結構數據結合功能實驗結論,揭示了D1R和D2R配體結合口袋的拓撲結構特性、受體激活機制、激動劑選擇性識別并激活D1R和D2R的分子機制、D1R的G蛋白偏好性激活決定因素以及D1R和D2R在G蛋白選擇性差異的結構基礎等。

以上研究成果為以D1R和D2R為藥物靶點的選擇性激動劑藥物的設計和開發,以及G蛋白信號偏好性D1R靶向藥物設計提供了重要的結構基礎和理論依據。研究論文“Structural insights into the human dopamine D1R and D2R receptor signaling complexes”,以長文形式于2021年2月11日在國際頂級期刊Cell雜志上在線發表。這是繼2月5日發表在Molecule Cell上D3R的工作之后徐華強課題組和張巖課題組在多巴胺能系統方向進行結構和功能系列研究的又一突出研究進展,進一步加深了人們對該系統的認識。

圖1. D1R-Gs和D2R-Gi復合物結構

研究發現,D1R在結構上表現為經典的七次跨膜螺旋結構,其中配體正構結合位點位于受體胞外端,由胞外loop以及跨膜螺旋部分組成;Gs蛋白偶聯界面位于受體胞內端,由近胞內端結構域組成。SKF81297、SKF83959以及apomorphine都屬于D1R的兒茶酚胺類激動劑,在與D1R的結合上,三種激動劑與受體上結合口袋的相互作用模式類似,其中最為典型的是配體上的氨基與D1033.32之間形成離子相互作用,這個作用位點在所有單胺類受體上及其保守。在結合模式上,三種激動劑的兒茶酚結構朝向TM5,但整體構象存在細微差別,而這種細微差別導致了不同配體在激活效力以及信號轉導通路偏好性的差異。通過對比D1R-SKF81297、D1R-SKF83959的結構細節,研究團隊發現,雖然SKF83959僅僅比SKF81297多了兩個甲基,然而,受到SKF83959結構上azepine環上額外的甲基與D1R上疏水氨基酸F3137.35、W3217.43空間位阻效應影響,相比于SKF81297,SKF83959更接近TM5并限制了TM5向跨膜區中心內移,使得SKF83959表現出比SKF81297更弱的激活效力,這與salmeterol部分激活β2AR的原理相似。此外,SKF83959作為D1R的G蛋白偏好性激動劑的機制長期以來始終未得到解釋,通過結構比對和β-arrestin募集實驗分析,研究團隊發現與SKF83959上azepine環內額外的甲基相互作用的D1R TM5上的氨基酸殘基F2886.51、F2896.52以及TM7上的V3177.39在SKF83959的G蛋白偏好性活性上起重要作用,為設計更為安全的G蛋白偏好性D1R激動劑提供了重要的結構基礎和理論依據。

研究人員對比D1R與非選擇性激動劑apomorphine的結構發現,apomorphine的結合比SKF化合物更遠離D1R的胞外loop 2(ECL2)。進一步比較D1R和D2R的結構,研究團隊發現D1R和D2R的ECL2在拓撲結構上存在明顯的差別,D2R的ECL2上的“CIIA”基序相比于D1R的“CDSS”基序更為靠近正構結合位點中心,如果SKF化合物和apomorphine以類似的模式結合到D2R,D2R的ECL2,尤其是氨基酸殘基I184,將與SKF化合物而不是apomorphine發生空間位阻效應。比較D2R-bromocritine的結構發現,bromocriptine遠離D2R ECL2區域,避免了與之發生位阻效應,這些結果表明ECL2在D1R和D2R的配體選擇性上發揮重要調控作用。Bromocriptine在對D1R的結合力上比D2R大概低50倍。通過D1R和D2R的結構比對發現,D1R的配體結合口袋更為狹窄,相比于D2R,D1R的TM6近胞外端往跨膜中心內移5.5 ?并于bromocriptine發生一定程度空間位阻,D1R上的非保守的帶正電氨基酸K81也在能量上不利于和bromocriptine的結合,這些因素共同決定了bromocriptine對D2R更高的親和力(圖2)。

圖2. D1R和D2R配體結合特性的比較

雖然D1R與D2R分屬于同一GPCR家族,然而在進化樹分析上D1R與β2AR更為接近。與之對應的是,在結構上,D1R和β2AR表現出高度的相似性,尤其是在跨膜區TM5-7,保守的P5.50I3.40F6.44基序以及DR3.50Y基序上,這些發現也預示著D1R和β2AR具有相似的激活機制。同為單胺類受體,D1R和β2AR表現出對不同單胺類神經遞質的選擇性。研究團隊發現,將D1R TM7上的V317突變成β2AR對應的氨基酸殘基天冬酰胺(N),能顯著性提高D1R對β2AR選擇性神經遞質腎上腺素及其衍生物異丙腎上腺素的結合效力,表明V3177.39在決定D1R對多巴胺而非其他單胺類神經遞質的選擇性上至關重要。

在下游G蛋白偶聯上,D1R主要偶聯到Gs,而D2R主要偶聯Gi??蒲腥藛T同時對兩者偶聯下游G蛋白選擇性的機制進行了探索。結果發現,激活態下D1R和D2R的近胞內端結構的構象差異直接引起各自在偶聯下游G蛋白的不同(圖3),這些差異體現在以下幾個方面:①. D1R TM6的近胞內端相比于D2R外移了8.4 ?,以容納Gαs上α5螺旋C末端龐大的氨基酸側鏈,而D2R近胞內端區域形成的凹腔不足以容納Gαs 的C末端復雜的氨基酸側鏈并與之發生空間位阻,相反,卻可以容納Gαi的C末端較為簡單的氨基酸側鏈,從而導致D1R和D2R對不同G蛋白的選擇性;②. D1R的TM5相比于D2R較長,往胞內區更多延伸了2.5個α螺旋并于Gαs的Ras結構域形成進一步的相互作用;③. D1R的ICL2相比于D2R多了1個α螺旋,使之與Gαs的Ras結構域形成更強的疏水相互作用網絡。這些因素表明TM6和α5螺旋等的構象決定著D1R和D2R對Gs/ Gi的選擇性,這也與徐華強研究員團隊在2018年報道的Rhodopsin-Gi結構通過分子動力學模擬所揭示的Gs/Gi選擇性機制相符合4。

圖3. D1R和D2R在G蛋白偶聯上的差異比較

綜上所述,研究團隊通過解析選擇性D1R激動劑以及非選擇性多巴胺受體激動劑激活下D1R-Gs以及D2R-Gi復合物的結構,結合功能試驗數據,闡釋了D1R和D2R在配體選擇性以及G蛋白選擇性識別上的機制等重要的生物學問題,為開發以D1R和D2R為靶標的選擇性藥物以及更為安全的抗神經精神疾病類藥物提供了重要的結構和理論基礎。

同時,2月11日同期Cell上,來自四川大學的邵振華團隊和北京大學的孫金鵬團隊以“背靠背”形式發表了“Ligand recognition and allosteric regulation of DRD1-Gs signaling complexes”的研究論文,該研究報道了D1R與不同激動劑配體以及D1R與變構調節劑的結構,揭示了D1R的激動劑配體以及變構調節劑的結合特性以及潛在的變構調節機制。值得一提的是,針對D1R與內源性配體dopamine以及正向變構調節劑的的結合以及調節機制這一科學問題,徐華強課題組、張巖課題組以及Bryan L. Roth課題組也開展了進一步的研究,相關成果已經以預印本形式在線發表在BioRxiv網站上(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.02.07.430101v1)。

本研究冷凍電鏡數據在上海藥物所冷凍電鏡平臺以及浙江大學冷凍電鏡中心收集。上海藥物所2020屆博士畢業生莊友文、上海藥物所博士生徐沛雨、浙江大學基礎醫學院博士后毛春友、美國匹茲堡大學博士后Lei Wang、北卡羅來納大學教堂山分校Brian. Krumm以及美國溫安洛研究所X. Edward. Zhou為該論文的共同第一作者。徐華強研究員、張誠教授、張巖教授以及Bryan L. Roth教授為共同通訊作者。上海藥物所為本研究第一完成單位。研究工作同時得到了上海藥物所蔣華良院士和美國溫安洛研究所Karsten Melcher教授的支持和幫助。該工作獲得了上海市市級科技重大專項、科技部重點研發計劃、中科院先導項目、國家自然基金委、浙江省自然基金委以及美國國立衛生研究院等的項目資金資助。

文章鏈接:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.027

參考文獻:

1. Beaulieu, J. M. & Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacological reviews 63, 182-217, doi:10.1124/pr.110.002642 (2011).

2. Missale, C., Nash, S. R., Robinson, S. W., Jaber, M. & Caron, M. G. Dopamine receptors: from structure to function. Physiological reviews 78, 189-225, doi:10.1152/physrev.1998.78.1.189 (1998).

3. Hall, A., Provins, L. & Valade, A. Novel Strategies To Activate the Dopamine D1 Receptor: Recent Advances in Orthosteric Agonism and Positive Allosteric Modulation. J Med Chem 62, 128-140, doi:10.1021/acs.jmedchem.8b01767 (2019).

4. Kang, Y. et al. Cryo-EM structure of human rhodopsin bound to an inhibitory G protein. Nature 558, 553-558, doi:10.1038/s41586-018-0215-y (2018).




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